对于生物样本的红外（IR）成像，最广泛应用且功能强大的技术是傅里叶变换红外（FTIR）显微光谱技术。该方法将标准红外光谱仪与显微镜结合，使您能够生成具有化学特异性的图像，揭示蛋白质、脂质和核酸等关键生物分子在组织切片或细胞群中的空间分布。
生物学红外成像的核心挑战不仅仅是选择一种技术，而是管理来自水的强烈红外信号，这可能会掩盖您寻求的分子数据。因此，您对仪器和样品制备方法的选择对于成功至关重要。
什么是红外成像？一张化学图谱
红外成像，也称为振动显微光谱，与标准光学显微镜根本不同。它不仅可视化形态，还提供有关样品化学成分的信息。
超越图像：创建高光谱图像
红外显微镜在图像的每个像素处测量完整的红外光谱。这创建了一个“高光谱数据立方体”，它是一系列图像的堆栈，其中每一层对应于特定红外频率下的光吸收。
通过分析这些数据，您可以生成假彩色图像，绘制特定化学成分在样品上的浓度和分布图。
“指纹”区域：识别关键分子
光谱的中红外区域（大约4000-400 cm⁻¹）会导致分子振动。不同的化学键（如蛋白质中的C=O，脂质中的C-H）以特征频率振动。
大约1800至900 cm⁻¹的区域被称为“指纹区域”，因为它包含独特的复杂峰模式，是特定分子所独有的。通过分析该区域，您可以识别和量化主要的生物分子类别。
主导技术：FTIR显微光谱技术
虽然存在其他方法，但FTIR显微光谱技术因其灵敏度、速度和多功能性的平衡而成为该领域的主力。
为什么选择FTIR？速度和灵敏度
现代傅里叶变换红外（FTIR）仪器同时收集所有频率的光，这比旧方法具有显著优势。这导致更高的信噪比和显著更快的采集时间，这对于绘制生物样本大面积区域的图谱至关重要。
“微观”优势：空间分辨率
将FTIR光谱仪与显微镜配对，可以将红外光束聚焦到小点。通过在样品上进行栅格扫描或使用焦平面阵列（FPA）探测器，您可以逐像素构建高光谱图像，解析从几十微米到几微米尺度的特征。
核心挑战：克服水干扰
生物样本红外分析的最大障碍是水。
为什么水是个问题
液态H₂O在中红外范围内具有极强且宽广的吸收带，尤其是在1640 cm⁻¹附近。这种信号如此强烈，以至于它可以完全饱和探测器并掩盖蛋白质中至关重要的酰胺I带，而酰胺I带对于研究蛋白质结构和浓度至关重要。
解决方案1：样品干燥和固定
最常见的方法是去除水。生物组织通常使用切片机进行切片，放置在特殊的红外透明载玻片（如CaF₂或BaF₂）上，然后干燥。
这可以通过风干、冷冻干燥（冻干）或使用甲醛或乙醇等化学固定剂来完成，类似于标准组织学。这有效地消除了水信号，提供了剩余生物分子的干净、高质量光谱。
解决方案2：与重水（D₂O）进行同位素交换
为了研究处于更“天然”或水合状态的样品，例如活细胞，H₂O可以与氧化氘（D₂O）或“重水”交换。
D₂O中的O-D键在更低的频率（大约1210 cm⁻¹）处吸收，将巨大的水峰移开，从而揭示指纹区域中的蛋白质、脂质和核酸信号。
了解权衡：测量模式
红外光如何与您的样品相互作用是另一个关键选择，每种模式都提供独特的优势。
透射
在透射模式下，红外光束直接穿过非常薄的样品。这种模式通常提供最高质量、最可量化的光谱，但需要精心准备的薄组织切片（通常为5-10 µm）。
反射（透反射）
更常见的是，样品在透反射模式下进行分析。组织放置在反射载玻片（如镜面或Low-e载玻片）上。红外光束穿过样品，从载玻片表面反射，然后再次穿过样品到达探测器。它更方便，但有时会引入光谱伪影。
衰减全反射（ATR）
ATR-FTIR成像是一种强大的表面敏感技术。样品与高折射率晶体（如锗）紧密接触。红外光不穿过样品；相反，“倏逝波”仅穿透样品表面几微米。
这对于从厚或高吸收性样品的表面获取高质量光谱而无需任何准备非常有用。其短光程自然地最大程度地减少了水干扰，使其成为分析水合样品的有力选择。
红外生物成像的新兴前沿
该领域正在不断发展，新技术的出现突破了速度和分辨率的极限。
同步加速器红外：实现终极分辨率
使用同步加速器光源提供的红外光束比传统热源亮1000倍。这允许衍射极限空间分辨率，从而能够对单细胞甚至亚细胞器进行化学成像。
量子级联激光器（QCLs）：实现前所未有的速度
这些系统不使用宽带热源，而是使用高功率、可调谐激光器。虽然它们通常不收集完整光谱，但可以将其调谐到几个关键频率，以在几分钟而不是几小时内绘制非常大区域的特定分子（如总蛋白质或脂质）的分布图。这正在改变高通量临床应用的潜力。
为您的目标做出正确选择
您选择的技术和样品制备完全取决于您的研究问题。
- 如果您的主要重点是诊断组织病理学：使用FTIR显微光谱技术以透射或透反射模式对薄的、干燥的和固定的组织切片进行分析，以识别疾病的生化标志物。
- 如果您的主要重点是研究活细胞或动态过程：考虑ATR-FTIR成像或在密封液体池中进行，并在用D₂O交换培养基后保持水合环境。
- 如果您的主要重点是亚细胞化学分析：您可能需要同步加速器红外光源提供的高亮度和空间分辨率。
- 如果您的主要重点是许多样品的高通量筛选：基于QCL的成像提供了快速绘制少量关键生物标志物分布图所需的速度。
最终，掌握生物样本的红外成像在于控制变量，以分离最重要的分子信号。
总结表：
| 技术 | 主要优势 | 最适合 |
|---|---|---|
| FTIR显微光谱 | 高灵敏度 & 速度 | 组织的一般化学绘图 |
| ATR-FTIR成像 | 最小样品制备，表面敏感 | 水合样品，活细胞 |
| 同步加速器红外 | 终极空间分辨率 | 亚细胞分析 |
| QCL成像 | 前所未有的速度 | 高通量筛选 |
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